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雷帕霉素藥物洗脫支架的生物安全性評(píng)價(jià)

文檔作者：陳斌祝君梅程鵬程琳李毅敏文檔來(lái)源：天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所天津市醫(yī)用生物材料監(jiān)測(cè)中心		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2021年05月21日
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生物醫(yī)學(xué)工程研究 2O14
Journal of Biomedical Engineering Rese~eh u1-。， 33(1}。： 52～55
雷帕霉素藥物洗脫支架的生物安全性評(píng)價(jià)
陳斌，祝君梅，程鵬，程琳，李毅敏△
(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所天津市醫(yī)用生物材料監(jiān)測(cè)中心，天津300020)
摘要：評(píng)價(jià)雷帕霉素藥物洗脫支架的生物安全性。依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T16886，通過(guò)l0項(xiàng)試驗(yàn)，對(duì)此材料
進(jìn)行生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)。試樣無(wú)溶血性、急性全身毒型、細(xì)胞毒性、遺傳毒性、致敏性，皮內(nèi)刺激試驗(yàn)中無(wú)刺
激性。在肌肉植入試驗(yàn)中，植入后1、4和12周對(duì)局部組織輕度刺激，26周無(wú)刺激作用。亞慢性全身毒性試
驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有給藥相關(guān)的肝毒性、心毒性、免疫毒性和脂代謝異常。亞慢性全身毒性采用的給藥方法可能并不適
用于此類材料，方案需要進(jìn)一步調(diào)整。其余試驗(yàn)中生物相容性尚可。
關(guān)鍵詞：生物安全性；醫(yī)療器械；雷帕霉素；全身毒性；肌肉植入試驗(yàn)
中圖分類號(hào)：R318 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672．6278(2014)01-0052-04
The Biological Safety Evaluation of Rapamycin Drug——eluting Stent
CHEN Bin，ZHU Junmei，CHENG Peng，CHENG Lin，LI Yimin
(Tianjin Institute of Pharmaceutical Science Tianjin Medwal Biological Materials Monitoring Center，Tianjin 300020，China)
Abstract：To evaluate the biological safety of Rapamycin drug—eluting stent．10 experiments were conducted to evaluate biological
safety according to the national standard GB／T16886．There was no hemolysis，systemic acute toxicity，cytotoxicity，genotoxicity，or intra—
cutaneous irritation．The result of muscle implant test showed that the samples had local tissue mild irritation on 1，4 and 12 weeks after
implantation，and no irritation on 26 weeks．The drug—related hepatotoxicity，cardiotoxic，immune toxicity and abnormal lipid metab—
olism were found in sub—chronic systemic toxicity．The medication of sub—chronic systemic toxicity test may not be applicable to such
materials．The programs should be further adjusted．The samples possess biological sa tv in other tests．
Key words：Biological safety；Medical devices；Rapamycin；Systemic toxicity；Muscle implant test
1 引 言
雷帕霉素藥物洗脫支架用于介入治療，在愈合
期，支架涂層緩控釋放雷帕霉素，阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞
增殖，可以抑制成型后血管的再狹窄 J，臨床研究
已證明，使用雷帕霉素洗脫支架的患者與使用裸金
屬支架的患者相比，其再狹窄率更低 ，并可減少
心臟不良事件 。
藥物支架在使用中需植入人體并長(zhǎng)期與血液接
觸，因此，產(chǎn)品的生物相容性關(guān)系到使用者生命健
康，對(duì)其進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)至關(guān)重要。目前的國(guó)
△通信作者Email：yiminl@sina．con
際標(biāo)準(zhǔn)還不完全適用于檢驗(yàn)藥物洗脫支架這類復(fù)雜
醫(yī)療器械，本研究根據(jù)GB／T16886系列國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)選
10項(xiàng)生物相容性試驗(yàn)，為藥物洗脫支架的體外安全
性評(píng)價(jià)提供參考。
2 材料與方法
2．1 樣品
由帶儲(chǔ)藥微孔的316 L不銹鋼基體和雷帕霉素
藥物涂層(含量1．6 g±20％／mm )組成的試棒，
直徑1 mm，長(zhǎng)10 mm。藥物濃度與雷帕霉素藥物洗
脫支架相同。植入試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)使用。
第1期 陳斌。等：雷帕霉素藥物洗脫支架的生物安全性評(píng)價(jià) 53
2．1．1 樣品浸提液制備Ames試驗(yàn)，將樣品以0．2
g／ml比例置生理鹽水(SC)和二甲基亞砜(DMSO)
中，50c【=下浸提72 h；急性和亞慢性毒性試驗(yàn)將樣品
與生理鹽水或棉籽油按0．2 g／ml浸提比例，在37℃
下浸提72 h。其余試驗(yàn)37％下浸提24 h。
2．2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)
采用四唑鹽(M1Tr)比色法，將96孑L板內(nèi)對(duì)數(shù)生
長(zhǎng)的L一929細(xì)胞在100 txl材料浸提培養(yǎng)液和對(duì)照
液培養(yǎng)72 h，將細(xì)胞與MTr反應(yīng)，產(chǎn)物用DMSO溶
解，觀察在570和630 nm下吸光度，計(jì)算相對(duì)增殖
率(RGR)。RGR=(檢品組A5 0一檢品組A 。。)／
(對(duì)照組A 一對(duì)照組A枷)×100％ 。
2．3 急性全身毒性試驗(yàn)
昆明種小鼠，隨機(jī)分2個(gè)試驗(yàn)組和2個(gè)對(duì)照組，
每組5只，試驗(yàn)組分別尾靜脈注射生理鹽水浸提液
或腹腔注射棉籽油浸提液，劑量50 ml／kg，對(duì)照組同
法分別注射生理鹽水或棉籽油，4、24、48和72 h后
觀察動(dòng)物的毒性反應(yīng)，記錄體重。
2．4 溶血試驗(yàn)
樣品2．5 g，加生理鹽水5．0 ml，37c(=下0．5 h，
陰性對(duì)照為生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照為蒸餾水，分別與
0．1 ml新鮮稀釋抗凝兔血混勻，37℃下1 h，測(cè)上清
液在545 nm的吸光度值，計(jì)算溶血率。溶血率=
(樣品吸光度一陰性對(duì)照吸光度)／(陽(yáng)性對(duì)照吸光
度一陰性對(duì)照吸光度)×100％ 。
2．5 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)
家兔2只，背部備皮并消毒，脊柱兩側(cè)各選擇
10個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)間隔2(3／／1，每點(diǎn)皮內(nèi)注射0．2 ml。左
側(cè)前5點(diǎn)注射樣品生理鹽水浸提液，后5點(diǎn)注射同
批號(hào)生理鹽水，右側(cè)前后5點(diǎn)分別注射棉籽油浸提
液和棉籽油。24、48和72 h后，按標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)注射局
部皮膚及周圍組織的反應(yīng)。
2．6 肌肉植入試驗(yàn)
家兔l8只，每個(gè)植入期4～5只，常規(guī)背部備皮
消毒并麻醉后，用穿刺針將4個(gè)樣品植入家兔左側(cè)
距脊柱2．5 cm的背部肌肉內(nèi)，樣品之間相距2 enl。
同樣形狀的硅橡膠對(duì)照試棒植入右側(cè)背部肌肉，1、
4、12和26周后切取植人物周圍組織做病理，評(píng)價(jià)
樣品對(duì)組織的刺激性。
2．7 遲發(fā)型超敏試驗(yàn)
豚鼠300～350 g，雌雄各半，分為2個(gè)不同浸
提介質(zhì)的受試組，2個(gè)陰性對(duì)照組和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照
組，每個(gè)受試組1O只豚鼠，對(duì)照組5只，豚鼠背部去
毛，做3對(duì)左右對(duì)稱的皮內(nèi)注射，注射弗式完全佐
劑、試液(浸提液，浸提介質(zhì)或陽(yáng)性物)和弗式完全
佐劑與試液的1：1混合乳液，每點(diǎn)0．1 ml。1周后
加強(qiáng)致敏，在原局部皮膚涂布相應(yīng)試液。再2周后
用相應(yīng)試液在腹部皮膚進(jìn)行24 h斑貼。去貼敷物
24和48 h后，給腹部貼敷處評(píng)級(jí)。
2．8 遺傳毒性試驗(yàn)
2．8．1 Ames試驗(yàn)平板滲入法，在活化(+s9)和
非活化(一S9)條件下，TA9，、TA 、TA o0、TA ∞菌株
各分2個(gè)浸提介質(zhì)的受試組，2個(gè)陰性對(duì)照組和1
個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組，每組三個(gè)平行培養(yǎng)皿。將浸提液或
對(duì)照液0．1 m1分別與2 ml溫頂層瓊脂液、0．1 ml受
試菌液混合后，澆在平皿內(nèi)底層瓊脂上，凝固后反轉(zhuǎn)
平皿，37cc培養(yǎng)72 h，計(jì)回變菌落數(shù)。
2．8．2 體外染色體畸變?cè)囼?yàn) 在+S9和一S9條
件下，各3個(gè)劑量組(浸提原液組，1／2和1／4浸提
原液組)，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，將CHL細(xì)胞
培養(yǎng)24 h?；罨鹘M用浸提液或?qū)φ找褐脫Q培養(yǎng)
液，接觸6 h，非活化各組接觸24和48 h；秋水仙素
處理4 h后收獲，低滲，制片，各組分析100個(gè)中期
分裂相細(xì)胞，用確切概率法統(tǒng)計(jì)畸變細(xì)胞數(shù)。
2．8．3 體外基因突變實(shí)驗(yàn)分組同上，將V79細(xì)
胞培養(yǎng)24 h。各組用浸提液或空白培養(yǎng)液、陰性對(duì)
照液(高密度聚乙烯)置換培養(yǎng)液，接觸4 h，再換培
養(yǎng)液培養(yǎng)20 h。細(xì)胞傳代并表達(dá)2次，每次3 d，表
達(dá)結(jié)束后，將細(xì)胞按200個(gè)／孔接種于6孔板上，7 d
后測(cè)定細(xì)胞克隆形成率(樣品組克隆數(shù)／非活化陰
性對(duì)照組克隆數(shù))，同時(shí)將細(xì)胞按1．5×10 個(gè)／孔種
于6孔板上，2 h后加含6-TG的培養(yǎng)液，培養(yǎng)10 d，
計(jì)錄TG克隆數(shù)，計(jì)算突變頻率，突變頻率=TG克
隆數(shù)／(接種細(xì)胞數(shù)×克隆形成率)，用柏松分布比
較法統(tǒng)計(jì)突變頻率。
2．9 亞慢性毒性試驗(yàn)
大鼠分受試組和對(duì)照組，每組20只，雌雄各半。
樣品組和對(duì)照組分別用生理鹽水浸提液和生理鹽水
尾靜脈注射，劑量為10 ml／kg。連續(xù)注射14 d，每周
記錄體重，末次注射24 h后，腹主動(dòng)脈采血進(jìn)行血
液學(xué)、血電解質(zhì)和生化學(xué)檢測(cè)，采集動(dòng)物心臟、肝臟
等28處器官或組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。用T檢
驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
3 結(jié)果
3．1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)
樣品浸提液的RGR為102．6％ 。認(rèn)為該樣品
無(wú)細(xì)胞毒性。
54 生物醫(yī)學(xué)工程研究 第33卷
3．2 急性毒性試驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠未發(fā)現(xiàn)死亡或其他毒性反應(yīng)，
兩個(gè)給藥途徑的樣品組的小鼠體重增長(zhǎng)和對(duì)照組之
間無(wú)明顯差異(P>0．05)，見(jiàn)表l。
表1 對(duì)照組和樣品組小鼠體重變化
Tablel The animals weight change of the control group
and the sam pling group
3．3 溶血試驗(yàn)
樣品組吸光度為0．009，陰性對(duì)照組吸光度為
0．008，陽(yáng)性組吸光度為0．848，樣品的溶血率為
0．1％。符合標(biāo)準(zhǔn)中溶血率<5％的要求。
3．4 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)
計(jì)算各組綜合平均記分，即反應(yīng)記分之和除以
計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)(2)，再除以時(shí)間點(diǎn)(3)，再除以動(dòng)物數(shù)
(2)，生理鹽水組樣品和對(duì)照反應(yīng)記分之和都為0，
綜合平均記分之差為0．0，棉籽油組樣品和對(duì)照反
應(yīng)記分之和分別為為28和30，綜合平均記分之差
為0．2。符合標(biāo)準(zhǔn)平均記分之差小于1．0的要求。
3．5 肌肉植入試驗(yàn)
各植入期顯微鏡下病理組織學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)表
2。認(rèn)為樣品在植人后1、4、12周對(duì)周圍組織有輕度
刺激，植入后26周，對(duì)周圍組織無(wú)刺激。
表2 肌肉植入實(shí)驗(yàn)的病理組織學(xué)半定量法評(píng)分和刺激程度分級(jí)
Table 2 Histopathological semi quantitative scoring method and
stinKllus degreeclassification ofnlasdeimplanta 咀由瑾舡tal
注：無(wú)刺激(差值0～2．9)，輕度(3．0—8．9)、中度(9．0～15．0)
和重度刺激(15．1以上)
3．6遲發(fā)超敏試驗(yàn)
樣品和對(duì)照組的豚鼠，在去除貼敷物24和48 h
后，激發(fā)部位無(wú)紅斑和水腫反應(yīng)(0級(jí))，陽(yáng)性對(duì)照組
在24 h后有3只豚鼠皮膚反應(yīng)評(píng)級(jí)為2級(jí)，3級(jí)和
4級(jí)各1只，48 h后，有1只1級(jí)，3只2級(jí)，1只4
級(jí)。認(rèn)為樣品浸提液未引發(fā)遲發(fā)超敏反應(yīng)。
3．7 Ames試驗(yàn)
2個(gè)樣品組與相應(yīng)陰性對(duì)照組比較，前者四種
菌株的回變菌落數(shù)均未達(dá)到后者的2倍。而陽(yáng)性組
回變菌落數(shù)高于陰性對(duì)照組3倍，認(rèn)為樣品無(wú)誘發(fā)
突變作用
3．8 體外染色體畸變?cè)囼?yàn)
在非活化條件下1／2浸提原液組和活化條件下
1／2、1／4浸提原液組的染色體畸變率為1％ ，陽(yáng)性組
為16％(24 h)和22％(48 h)，活化條件下陽(yáng)性組為
17％ ，其余各組都是O％ ，各劑量組間無(wú)量效關(guān)系。
認(rèn)為樣品無(wú)誘發(fā)染色體畸變作用。
3．9 細(xì)胞體外基因突變實(shí)驗(yàn)
三個(gè)梯度劑量樣品組的基因突變頻率與陰性組
比較均未增加3倍，各劑量組間無(wú)量效關(guān)系。樣品
浸提液在此實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)V79細(xì)胞無(wú)誘發(fā)突變作
用。
3．10 亞慢性毒性試驗(yàn)
受試組雄性大鼠體重顯著低于對(duì)照組。病理組
織學(xué)顯示，樣品組中3只雄性和7只雌性大鼠肝有
多發(fā)的較大壞死灶，而受試組ALT、AST等指標(biāo)異常
升高，表明給藥對(duì)大鼠的肝臟有毒性反應(yīng)。另外，樣
品組TC等脂代謝指標(biāo)顯著升高。樣品組WBC比
對(duì)照組減少，雌性的脾臟、胸腺指數(shù)、雄性的胸腺指
數(shù)比對(duì)照組降低，提示給藥對(duì)大鼠有免疫抑制。另
外病理組織學(xué)還發(fā)現(xiàn)樣品組6只雄性和4只雌性大
鼠心肌有單發(fā)或多發(fā)壞死灶。
表3 亞慢性毒性試驗(yàn)中血液學(xué)和血液生化學(xué)檢測(cè)結(jié)果
Table 3 Results of hematology an d blood biochemi stry
in sub—chronic systemic toxicity test
WBC(109／L) 5．71±1．49
ALT(U／L) 45．50±11．67
AST(U／L) 133．90±13．05
TC(mmoVL) 1．63±O．28
TG(mmol／L) 0．48±0．20
Glu(rnmol／L) 6．47±0．86
3．49±0．94”
84．加±17．13¨
153．00±29．52
2．33±0．42”
0．86±0．52
6．72±0．44
lO．56±2．50
51．40±10．12
115．40±15．29
1．52±0．19
O．54±0．17
5．19±0．79
與對(duì)照組比較{P<0．05； }P(O．01
4 討論
結(jié)果顯示細(xì)胞毒性、急性全身毒性、溶血、皮內(nèi)
刺激試驗(yàn)、遲發(fā)超敏和遺傳毒性試驗(yàn)均符合要求。
5 卯
第1期 陳斌。等：雷帕霉紊藥物洗脫支架的生物安全性評(píng)價(jià) 55
肌肉植入實(shí)驗(yàn)中樣品在植入后1、4、12周對(duì)周
圍組織有輕度刺激，植入后26周，對(duì)周圍骨組織無(wú)
刺激。輕度刺激有可能與釋放的雷帕霉素有關(guān)。26
周時(shí)無(wú)刺激提示雷帕霉素已基本釋放并被組織代
謝。有報(bào)道說(shuō)雷帕霉素有組織刺激作用，如20 g／ml
的雷帕霉素滴眼液對(duì)角膜有刺激作用 ]。
俞夢(mèng)越 研究雷帕霉素洗脫支架在植入小型
豬冠脈后，藥物在24 h內(nèi)釋放約85％ ，且大部分被
局部吸收，進(jìn)入血液的藥量不超過(guò)5％ 。而本次亞
慢性毒性試驗(yàn)中將支架浸提72 h，并連續(xù)14 d經(jīng)靜
脈給藥，使雷帕霉素大量不斷進(jìn)人試驗(yàn)動(dòng)物的血液
循環(huán)，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)明顯的免疫抑制、肝毒性、脂代
謝異常，與高劑量雷帕霉素導(dǎo)致相關(guān)不良反應(yīng)的報(bào)
道 。 一致。未見(jiàn)雷帕霉素給藥發(fā)現(xiàn)心肌壞死的報(bào)
道。不能排除因不適合的給藥方法產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)
果。建議經(jīng)靜脈途徑的亞慢性毒性試驗(yàn)，在制備浸
提液時(shí)應(yīng)將藥物與帶載藥材料或儲(chǔ)藥孔的支架分
開，合理分配浸提液中的雷帕霉素藥量?；蛲ㄟ^(guò)皮
下或其他植入途徑測(cè)定洗脫支架的亞慢性毒性試
驗(yàn)，達(dá)到更好的安全性檢驗(yàn)效能。
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(收稿日期：2014—02—17)

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