摘要：針對污水處理廠生產高品質再生水過程中低壓反滲透單元(DFRO)產生的反滲透濃水中TN濃度高和NOx?Ox--N(NO?3O3--N+NO?2O2--N)占比高的問題,采用反硝化MBBR處理實際反滲透濃水,研究不同底物濃度下反硝化MBBR的脫氮效能和反硝化基因拷貝數的變化。結果表明:進水NO?3O3--N濃度為(8.70±6.34)~(24.23±8.69)mg/L,TN濃度為(28.43±5.69)~(44.10±7.37)mg/L時,隨著濃度的升高NO?3O3--N和TN去除率保持平穩(wěn),但NO?3O3--N和TN去除速率上升,NO?2O2--N去除率和去除速率下降。進水NO?2O2--N濃度為(10.94±8.51)~(20.94±5.78)mg/L時,隨著濃度的升高,NO?3O3--N和TN去除率及去除速率降低,NO?2O2--N去除率及去除速率上升。反硝化MBBR填料生物膜主要由球菌、桿菌和少量絲狀菌組成;填料生物膜和底泥中各脫氮基因拷貝數隨NO?3O3--N和TN濃度增加而增大,nirK、nirS和Anammox等基因拷貝數也隨NO?2O2--N濃度增加而增大。

關鍵詞：反滲透濃水;反硝化MBBR;底物濃度;脫氮基因;NO?2O2--N積累

MBBR(moving bed biofilm reactor)是在反應器中填充密度接近于水的填料,利用填料上的生物膜和活性污泥同時去除污水中污染物的微生物處理工藝,具有高效靈活、耐沖擊負荷、剩余污泥少和脫氮除磷效率高等優(yōu)點[1]。近年來,反硝化MBBR被用于生活污水和海水中氮的深度去除[2,3,4]。反硝化MBBR用于處理被NO?3O3--N污染的海水時,反硝化速率達(17.7±1.4)g/(m2·d)[3];用于處理生活污水時,TN去除率可達94%[5]。前置和后置反硝化MBBR在用于污水處理廠的深度處理時,TN去除率可達90%[2]。苑泉等[6]在進水TN濃度為9.7 mg/L時,用反硝化MBBR處理二沉池出水,TN去除率達到50%。反硝化MBBR運行過程中會受到包括底物濃度、溫度、碳氮比、水力停留時間(HRT)和填料類型等因素的影響,進水中氮負荷的變化會影響反硝化脫氮效能和反硝化微生物群落結構[7]。在對垃圾滲濾液進行反硝化和厭氧氨氧化協同脫氮時,當TN負荷由15 g/(m3·d)增至25 g/(m3·d)時,TN去除率由67.7%降至60.2%[8];而在水體中TN濃度為1.21~6.50 mg/L時,反硝化細菌群落結構也會發(fā)生相應變化[9]。上述研究均表明,進水底物濃度會影響生物的脫氮效能和微生物群落結構。

在全世界水資源匱乏日漸嚴重的形勢下,反滲透技術(reverse osmosis,RO)因具有處理效率高、能源消耗低和占地面積小等優(yōu)點[10]逐漸被用于城市污水處理廠尾水的處理和生產高品質水工藝中。但RO在生產高品質回用水的同時也會產生反滲透濃水,氮等物質會在反滲透濃水中富集。低壓反滲透單元(DFRO)被用于城市污水廠出水生產高品質再生水,在該過程中DFRO產生的反滲透濃水具有TN濃度高和NOx?Ox--N(NO?3O3--N +NO?2O2--N)占比高等特點[11],亟需對NO?2O2--N、NO?3O3--N和TN進行深度去除。目前國內外應用反硝化MBBR處理的污水有城鎮(zhèn)污水、污水處理廠尾水和海水等[12],鮮見將其用于處理高品質再生水過程中產生的反滲透濃水的研究。針對反滲透濃水TN濃度高和NOx?Ox--N占比高的問題,筆者采用反硝化MBBR處理實際反滲透濃水,研究底物濃度對其脫氮效能及脫氮相關基因的影響,考察不同底物濃度下反硝化MBBR對NO?2O2--N、NO?3O3--N和TN的去除效能,揭示反硝化基因等脫氮基因對不同底物濃度下反硝化MBBR脫氮效能的響應。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

反硝化MBBR裝置采用有機玻璃制成。反應器為圓柱型,內徑0.25 m,高0.25 m,有效體積為12 L(圖1)。其中填充本課題組研發(fā)的液相氧化-水浴接枝丙烯酸改性聚乙烯填料[13],填料性能參數見表1。

1.2 試驗設計

取北京某污水處理廠缺氧池中的污泥接種,接種后反應器內污泥混合液懸浮固體(MLSS)濃度為3 544 mg/L,混合液揮發(fā)性固體(MLVSS)濃度為1 897 mg/L,MLVSS/MLSS為0.54。采用連續(xù)流進水方式,根據實際反滲透濃水進水中NO?3O3--N、NO?2O2--N和TN的濃度變化特征,分4個階段(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)研究底物濃度對MBBR反硝化效能的影響。用加熱棒控制溫度為24~27 ℃,HRT為12 h,填料填充率為30%,采用電動攪拌器攪拌使填料和污泥保持懸浮狀態(tài)。適當補充甲醇作為外加碳源,使進水COD/TIN為2.9~4.8,反應器中溶解氧濃度低于0.5 mg/L。各階段進水水質見表2。

1.3 水質分析方法

測定的水質指標、分析方法和所用儀器如表3所示。每4 d取樣1次,水樣經0.45 μm濾膜過濾后測定NH+4H4+-N、NO?2O2--N和NO?3O3--N濃度,靜置后取上清液測定其他指標。試驗中所用藥品均為分析純(國藥集團化學試劑北京有限公司)。

1.4 微生物及分子生物學分析

在每個階段穩(wěn)定期,取適量填料和底泥進行生物量、掃描電鏡(SEM)及熒光定量PCR(qPCR)測定。

生物量測定:取一定量各階段穩(wěn)定期的反硝化MBBR填料浸于1 mol/L的NaOH溶液中,經80 ℃水浴30 min后,100 W超聲1 min,渦旋振蕩30 s,測定溶液中SS濃度[6]。

SEM觀察[15]:取各階段穩(wěn)定期反硝化MBBR填料,用無菌剪剪至5 mm×5 mm的小塊,用2.5%中性戊二醛固定,磷酸緩沖液清洗,乙醇梯度脫水,進行臨界點干燥和噴金后,置于SEM電鏡下觀察。

qPCR測定:在ABI 7500型熒光定量PCR儀(Life Technologies,美國)對各階段穩(wěn)定期的填料生物膜和底泥樣品進行qPCR分析,對16S rRNA基因、厭氧氨氧化細菌基因(Anammox)和反硝化中編碼硝酸鹽還原酶功能基因(narG)、編碼cytoome cd1亞硝酸鹽還原酶基因(nirK)、編碼copper亞硝酸鹽還原酶基因(nirS)和編碼N2O還原酶基因(nosZ)的拷貝數進行定量分析,各目的基因的引物序列見表4。

用土壤基因組DNA提取試劑盒(MP Biomedicals,美國)提取生物膜和底泥樣品的DNA。20 μL的qPCR混合反應物由16.4 μL的2X Taq Plus Master Mix(Vazyme Biotech,美國),2 μL的模板DNA,0.8 μL的正向引物和0.8 μL的反向引物組成。qPCR的反應條件:95 ℃預變性5 min;在不同溫度下(16S rRNA基因、narG和nirS,60 ℃;nirK,54 ℃;nosZ,56 ℃;Anammox,55 ℃)變性30 s,共40個循環(huán);最后72 ℃延伸40 s。每個樣品設3個平行樣。用Nano Drop 2000 分析儀(Thermo Fisher Scientific, 美國)監(jiān)測構建質粒的數量與質量。以10倍梯度稀釋反硝化細菌及各功能基因重組質粒進行qPCR(博日9600Plus,中國)檢測,獲得16S rRNA基因、Anammox及各功能基因標準曲線。R2為0.994 9~0.999 9,擴增效率為84.8%~99.7%。

2 結果與討論

2.1 底物濃度對反硝化MBBR脫氮效能的影響

2.1.1 底物濃度對去除NO?3O3--N的影響

2.1.1.1 進水TN和NO?3O3--N濃度

由表2可知,Ⅲ階段相對于Ⅱ階段,進水NO?2O2--N和NH+4H4+-N濃度基本未變。由圖2(a)可見,進水NO?3O3--N和TN濃度分別由(8.70±6.34)和(28.43±5.69)mg/L增至(24.23±8.69)和(44.10±7.37)mg/L時,NO?3O3--N去除率分別為83.9%±4.01%和80.69%±7.46%;反硝化速率由(15.48±3.80)g/(m3·d)增至(44.58±3.67)g/(m3·d)?？梢姺磻鲀任⑸飳O?3O3--N和TN濃度增加適應良好,對NO?3O3--N去除率影響不大,反硝化率隨濃度增加而增加。在生物活性炭硫反硝化脫氮系統(tǒng)中,當進水NO?3O3--N濃度為10~40 mg/L時,NO?3O3--N去除率基本未變化[22],與本研究結果一致,但其NO?3O3--N去除率在93%以上,高于本研究,可能與反滲透濃水水質復雜有關。

用土壤基因組DNA提取試劑盒(MP Biomedicals,美國)提取生物膜和底泥樣品的DNA。20 μL的qPCR混合反應物由16.4 μL的2X Taq Plus Master Mix(Vazyme Biotech,美國),2 μL的模板DNA,0.8 μL的正向引物和0.8 μL的反向引物組成。qPCR的反應條件:95 ℃預變性5 min;在不同溫度下(16S rRNA基因、narG和nirS,60 ℃;nirK,54 ℃;nosZ,56 ℃;Anammox,55 ℃)變性30 s,共40個循環(huán);最后72 ℃延伸40 s。每個樣品設3個平行樣。用Nano Drop 2000 分析儀(Thermo Fisher Scientific, 美國)監(jiān)測構建質粒的數量與質量。以10倍梯度稀釋反硝化細菌及各功能基因重組質粒進行qPCR(博日9600Plus,中國)檢測,獲得16S rRNA基因、Anammox及各功能基因標準曲線。R2為0.994 9~0.999 9,擴增效率為84.8%~99.7%。

2.1.1.2 進水NO?2O2--N濃度

由表2可知,Ⅱ階段相對于Ⅰ階段,進水TN濃度基本未變,但由圖2(b)可見,NO?3O3--N濃度減少6.20 mg/L,NO?2O2--N濃度增加10.00 mg/L;Ⅲ階段相對于Ⅳ階段,進水TN濃度基本未變,NO?3O3--N濃度減少5.62 mg/L,NO?2O2--N濃度增加6.45 mg/L。由2.1.1.1節(jié)可知,進水NO?3O3--N濃度對NO?3O3--N去除率影響不大,因此只考慮NO?2O2--N濃度對NO?3O3--N去除的影響。

Ⅱ階段相對于Ⅰ階段,NO?3O3--N去除率降低5.86個百分點,反硝化速率降低12.19 g/(m3·d);Ⅲ階段相對于Ⅳ階段,NO?3O3--N去除率降低4.52個百分點,反硝化速率降低8.21 g/( m3·d)。由以上分析可知,隨著NO?2O2--N濃度的增加,NO?3O3--N去除率和反硝化速率均下降。王少坡等[23]報道在進水(NO?3O3--N+ NO?2O2--N)濃度一定時,NO?2O2--N占比越高,反硝化結束時反應器內pH越高;而反應器內pH升高可能會超出反硝化最適pH,從而降低NO?3O3--N去除率和反硝化速率[24]。王亞宜等[25]研究發(fā)現,當NO?2O2--N濃度由5.5 mg/L增至15.0 mg/L時,序批式活性污泥反應器反硝化速率降低。

2.1.2 底物濃度對去除NO?2O2--N的影響

2.1.2.1 進水TN和NO?3O3--N濃度

由圖3可見,Ⅲ階段于相對于Ⅱ階段,NO?2O2--N去除率由86.55%±3.73%降至76.46%±6.69%;同時NO?2O2--N去除速率也由(42.66±5.46)g/(m3·d)降至(31.81±2.66)g/(m3·d)。可見隨著TN和NO?3O3--N濃度增加,NO?2O2--N去除率和去除速率均下降。可能是因為在反硝化過程中,每消耗1 g NO?3O3--N或NO?2O2--N產生3.57 g堿度(以CaCO3計),反硝化過程可導致反應器內pH升到9以上,且進水NO?3O3--N濃度越高,產生的堿度越高[26]。有報道指出,當pH為9.2時,控制NO?2O2--N還原的nirK基因活性受到抑制,NO?2O2--N形成積累[27]。由2.1.1.1節(jié)可知,Ⅲ階段與Ⅱ階段相比,反硝化速率增加,產生的堿度高,造成的NO?2O2--N積累率高,因此NO?2O2--N去除率和去除速率均下降。

2.1.2.2 進水NO?2O2--N濃度

由圖3可見,Ⅱ階段相對于Ⅰ階段,NO?2O2--N去除率由69.07%±5.63%增至86.55%±3.73%,NO?2O2--N去除速率也由(13.81±2.85)g/(m3·d)增至(42.66±5.46)g/(m3·d)。Ⅲ階段相對于Ⅳ階段,NO?2O2--N去除率增加1.68個百分點,NO?2O2--N去除速率也由(18.21±2.42)g/(m3·d)增至(31.81±2.66)g/(m3·d)。由此可知,隨著NO?2O2--N濃度的升高,NO?2O2--N去除率和去除速率增加。一方面,NO?2O2--N增多有利于厭氧氨氧化反應的進行[28]。另一方面,有報道稱,當NO?2O2--N濃度小于30 mg/L時,隨著濃度的升不高,反硝化電子受體增加,NO?2O2--N去除速率隨之增加,但當進水NO?2O2--N濃度大于40 mg/L時,隨著濃度的升高,反硝化速率下降[29]。

2.1.3 底物濃度對去除TN的影響

2.1.3.1 進水TN和NO?3O3--N濃度

由圖4(a)可見,Ⅲ階段和Ⅱ階段的TN去除率分別為78.47%±8.65%和76.95%±9.40%,變化不大;但TN去除速率由Ⅱ階段的(50.19±7.19)g/(m3·d)增至Ⅲ階段的(69.08±10)g/(m3·d)。可見NO?3O3--N和TN濃度的增加,對TN去除率影響不大,TN去除速率隨濃度增加有所增加,反應器內微生物對NO?3O3--N和TN濃度增加適應良好。王亞宜等[30]發(fā)現,初始NO?3O3--N濃度越高,反硝化速率越快;反硝化速率越大,TN去除率也越高[22]。

2.1.3.2 進水NO?2O2--N濃度

由2.1.3.1節(jié)可知,進水NO?3O3--N濃度對TN去除率影響不大,因此只考慮NO?2O2--N濃度對去除TN的影響。由圖4(b)可見,Ⅱ階段相對于Ⅰ階段,TN去除率和去除速率分別降低3.15個百分點和1.15 g/(m3·d);Ⅲ階段相對于Ⅳ階段,TN去除率和去除速率分別降低5.88個百分點和4.07 g/(m3·d)。由此可知,隨著NO?2O2--N濃度的升高TN去除率和反硝化速率均稍有下降,這可能是因為進水NO?2O2--N濃度對反硝化微生物具有抑制作用,隨著NO?2O2--N濃度增加,抑制作用增強,硝酸還原菌等脫氮菌的活性降低所致。

2.2 底物濃度對反硝化MBBR微生物群落影響

2.2.1 生物量變化

Ⅲ階段填料生物量(7.29 mg/g)與Ⅱ階段(16.06 mg/g)相比,減少了8.77 mg/g。結合2.1節(jié)可知,Ⅲ階段與Ⅱ階段相比,NO?3O3--N和TN去除率高,NO?2O2--N去除率低。有報道指出,MBBR填料生物量越大處理負荷不一定越高[12],也可能是Ⅲ階段生物膜中的有效細菌較多,同時其底泥中生物量也多。

Ⅱ階段填料生物量(16.06 mg/g)與Ⅰ階段(16.34 mg/g)相比,稍有下降;Ⅲ階段填料生物量(7.29 mg/g)遠低于Ⅳ階段(25.94 mg/g)。這與4個階段各種氮物質去除率變化一致。

2.2.2 填料表面生物膜形態(tài)觀察

對穩(wěn)定期的填料表面進行SEM掃描,觀察其表面掛膜情況和微生物組成,結果如圖5所示。由圖5可見,Ⅰ階段和Ⅱ階段填料表面生物膜致密,主要為絲狀菌、球菌和桿菌,并且球菌較多,桿菌和絲狀菌相對較少。Ⅲ階段的生物膜較稀薄,主要以桿菌和絲狀菌為主,球菌較少。而在Ⅳ階段,生物膜相較Ⅰ~Ⅲ階段更為均勻密實,且球菌的比例增多。球菌可能為反硝化細菌中的微球菌屬,而典型的反硝化假單胞菌屬和色桿菌屬均呈桿狀[31]。

2.2.3 生物膜和底泥中脫氮基因拷貝數變化

用qPCR測定各階段穩(wěn)定期的生物膜和底泥樣品中基因拷貝數,結果如圖6所示。由圖6可見,Ⅲ階段生物膜樣品中16S rRNA 基因、narG、nirK、nirS、nosZ和Anammox基因拷貝數分別為(7.7×1010±5.3×109)、(3.2×107±1.5×106)、(1.7×108±8.3×106)、(1.4×1010±6.1×108)、(1.1×107±3.2×106)和(3.0×106±4.9×105)個/g,除nirK、nirS和Anammox基因外,均高于Ⅱ階段;Ⅲ階段底泥樣品中除nirK和Anammox基因外也均高于Ⅱ階段。各脫氮基因拷貝數隨底物濃度增加而增大,因此TN和NO?3O3--N去除率變化不大,但二者的去除速率隨濃度增加而增大。反硝化過程包括4個連續(xù)的步驟,其中nirS和nirK基因驅動將NO?2O2-逐步還原為NO,并在其他基因作用下最終還原為N2,是NO?2O2-轉化的關鍵基因,也是研究最為廣泛的基因[32],Anammox基因是典型厭氧氨氧化基因(與NO?2O2-去除密切相關)[33]。Ⅲ階段相比于Ⅱ階段上述基因拷貝數的降低也與NO?2O2--N去除率和去除速率下降一致。

圖64個階段填料生物膜和底泥中各基因拷貝數

Fig.6The copy numbers of genes in carrier biofilm and activated sludge of four stages

Ⅱ階段生物膜樣品中16S rRNA、narG、nirK、nirS和nosZ和Anammox基因拷貝數分別為(5.9×1010±4.6×109)、(1.3×107±1.1×106)、(4.0×108±3.7×107)、(1.7×1010±5.4×108)、(6.1×106±4.9×105)和(1.5×107±3.2×106)個/g,除narG基因外,均高于Ⅰ階段;Ⅱ階段底泥樣品中所有基因拷貝數均高于Ⅰ階段;并且Ⅱ階段的Anammox基因拷貝數明顯高于Ⅰ階段,這與Ⅱ階段NO?2O2--N去除率和去除速率高于Ⅰ階段相一致;但Ⅱ階段NO?3O3--N和TN去除率和去除速率稍低于Ⅰ階段,可能與Ⅱ階段中narG基因拷貝數較低有關。

Ⅲ階段生物膜樣品中,除16S rRNA基因和Anammox基因外,反硝化narG、nirK、nirS和nosZ基因拷貝數均低于Ⅳ階段,這也與Ⅲ階段與Ⅳ階段相比NO?3O3--N和TN去除率和去除速率均降低一致;在nirS基因拷貝數基本接近的情況下,Ⅲ階段的Anammox基因拷貝數明顯高于Ⅳ階段,這有利于厭氧氨氧化的發(fā)生和NO?2O2--N的去除[5],因此Ⅲ階段與Ⅳ階段相比,NO?2O2--N去除率和去除速率增加。

此外,NO?2O2--N還原酶的編碼基因中,4個階段的nirS基因拷貝數均比nirK基因拷貝數高1~2個數量級,這與其他生物系統(tǒng)的脫氮基因研究結果相一致[34,35,36]。相關報道指出,nirK基因比nirS基因對于厭氧環(huán)境的要求更高[37],導致nirK基因拷貝數較低;且nirS基因在已研究過的反硝化細菌中分布更廣,而僅有30%的菌株含有nirK基因[38]。Ⅱ階段的Anammox基因拷貝數比其他階段高1~4個數量級,推測是由Ⅰ階段高NO?2O2--N積累率引起,這也導致Ⅱ階段NO?2O2--N去除率和去除速率均較高。

3 結論

(1)在穩(wěn)定期內進水中NO?3O3--N、NO?2O2--N和TN濃度分別為(8.70±6.34)~(29.85±5.27)、(10.94±8.51)~(20.94±5.78)和(26.68±11.87)~(44.10±7.37)mg/L時,反硝化MBBR對NO?3O3--N、NO?2O2--N和TN的去除率分別為(80.69%±7.46%)~(89.76%±4.02%)、(69.07%±5.63%)~(86.55%±3.73%)和(76.95%±9.4%)~(84.35%±6.18%),具有穩(wěn)定的反硝化效能。

(2)進水NO?3O3--N濃度為(8.70±6.34)~(24.23±8.69)mg/L,TN濃度為(28.43±5.69)~(44.10±7.37)mg/L時,NO?3O3--N和TN去除率變化不大,但二者的去除速率隨濃度增加而增加,NO?2O2--N去除率和去除速率下降,這與NO?3O3--N濃度越高產生的堿度越高,導致NO?2O2--N積累率較高有關。

(3)進水NO?2O2--N濃度為(10.94±8.51)~(20.94±5.78)mg/L時,NO?3O3--N和TN去除率及去除速率均隨濃度升高而下降,這可能是因為進水NO?2O2--N濃度對反硝化微生物具有抑制作用;NO?2O2--N的平均去除率及去除速率均上升,這與Anammox基因等脫氮基因拷貝數增多有關。

(4)反硝化MBBR生物膜主要由球菌、桿菌和少量的絲狀菌組成。生物膜(除nirK、nirS和Anammox基因)和底泥(除nirK和Anammox基因)中各脫氮基因拷貝數隨NO?3O3--N和TN濃度增加而增大;隨NO?2O2--N濃度增加,nirK、nirS和Anammox等基因拷貝數也相應增加。4個階段的基因拷貝數變化與NO?3O3--N、NO?2O2--N和TN去除效果變化一致。